红外光谱通常是指频率在14 300-20 cm-1 (0.7-500 μm) 范围内的电磁波。通常将红外光谱分为3个区域:近红外区 (0.78-3 μm) 、中红外区 (3-50 μm) 、远红外区 (50-100 μm) 。近红外光谱主要是分子内原子的C-H、O-H、N-H等含氢基团振动光谱的倍频和合频吸收, 可对样品进行定性分析, 多用于定量分析;中红外光谱属于分子的基频振动光谱, 多用于样品的定性分析;远红外光谱为分子的转动光谱和某些基团的振动光谱。红外光谱仪主要分为色散型红外光谱仪和傅里叶光栅光谱仪。为近年来迅速发展起来的一项新的检测技术, 能够高效、快速和低成本、准确地对固体、液体及粉末状的有机物样品进行无损检测。而中药本身为一个极其复杂的混合物体系, 它们的鉴别和质量控制、有效成分的确定和定量分析, 一直是中医药领域的一个难题[1]。红外指纹图谱专属性强, 重现性好, 操作方便, 能够提供极其丰富的分子信息。近年来, 红外光谱已成为中药研究中必不可少的工具[2], 该方法广泛用于制药[3,4,5,6]、医学检验[7,8]、中药分析[9,10,11,12,13,14,15,16,17]等领域。在国内, 孙素琴团队创立了"多级红外光谱宏观指纹分析法", 并结合化学计量学方法应用于中药质量监控研究, 并获得了丰硕成果[18];浙江大学在线近红外研究团队对复方苦参注射液、痰热清注射液等产品生产过程指标成分进行在线监测[19,20]。随着红外光谱技术、计算机科学及化学计量学的发展, 该方法越来越广泛的应用于中药材和中药制剂的定性和定量分析, 本文就近年来近红外和中红外光谱法在中药领域的研究与应用概况进行综述。
1 红外光谱在中药材定性和定量分析中的应用
1.1 中药材的真伪鉴别
中药材来源的真伪直接影响到中药饮片及其制剂的质量, 只有从源头对中药的真伪进行鉴别, 保证中药质量的好坏, 才能从根本上解决市场上中药品种混乱、以假乱真、以次充好的现象, 从而进行中药市场规范化管理。传统的中药鉴别方法以经验法、显微法和理化鉴别为主, 其中经验法在很大程度上受主观因素的影响, 而显微法和理化鉴别法需对样品进行复杂处理、耗时耗力, 且显现的是中药材中单一成分或部分成分的信息。红外光谱可以系统、全面的反应中药材不同种属、不同产地、不同炮制方法等在化学成分上存在的差异, 为中药的鉴别提供科学的依据。
1.1.1 中药材的分类鉴别
周晔等[21]利用傅里叶变换光谱结合光谱共有峰率、变异峰率双指标系列和二阶导数光谱法对胡椒属7种药用植物进行分析, 结果表明胡椒属药用植物海风藤及同属其他植物光谱存在差异。孙国明等[22]采用近红外光谱结合聚类分析法对独活属18种药用植物进行研究, 结果表明该方法与经典分类学分析相一致。类似的研究尚有, 近红外光谱和傅里叶变换光谱法用于阿魏亚族[23]和石斛属[24]药用植物的鉴别。采用红外光谱法进行中药材的分类, 是建立在样品化学成分的差异, 从而图谱的差异反映了分子组成的的差异, 与传统的形态鉴别和分析分类方法相比, 红外光谱法可快速、无损地用于中药分类及亲缘关系的分析及品种的鉴别。
1.1.2 中药材掺杂鉴别
中药材以假乱真、以次充好的现象在市场上尤为普遍, 尤其是一些名贵中药或药材粉末, 很难从外形上区分其质量的好坏, 因此需要借助相关的技术对其进行快速检测。周健等[25]利用傅里叶变换红外光谱结合二阶导数光谱法, 测定了天然麝香及其伪品的红外光谱, 获得麝香的特征吸收峰, 该指纹特征可作为天然麝香、市售麝香、人工麝香及其伪品鉴别依据。钟建理等[26]和Zhu X R等[27]分别采用近红外光谱法结合化学计量学的方法, 建立分类模型用于沉香和蜂蜜的真伪及掺杂鉴别。中药种类繁多, 真伪混乱, 故真伪鉴别是一项重要任务, 红外光谱法较性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别等方法快速与无损, 对中药的质量控制具有重要意义。
1.2 中药的优劣鉴别
中药材的产地、药用部位、采收时期和炮制方法等因素会影响中药材中有效成分的含量, 从而影响到药材的质量。只有确定合理的药用部位、采收时间及炮制方法, 才能获得质优、效佳的中药材, 从而保证中药的临床疗效。
1.2.1 中药材产地的鉴别
优质的中药材是特定地理环境和气候等因素共同作用的结果, 道地药材大多产地适宜、品种优良、产量宏丰、疗效显著。当前, 道地药材的形成和鉴别研究是人们关注的重点。近年来, 学者们采用红外光谱法对中药不同产地的药材品种进行系统的研究。毛晓丽等[28]对广西4个产地144个两面针样品进行模式识别研究, 结果表明该方法可准确地提取样品的整体信息, 所建模型对未知样品进行预测的识别率达90%。袁玉峰等[29]利用傅里叶变换红外光谱法结合主成分分析方法对6个不同产地的黄柏进行研究, 结果表明前3个主成分数的累积贡献率达到98%, 样本在空间聚集成不同的类别。Anastasaki E等[30]对4个不同产地250个藏红花样品进行鉴别, 红外光谱对藏红花的柱头及其乙醚提取液的分类校正判别率为93.6%, 对希腊、伊朗、意大利、西班牙4个不同产地的藏红花进行准确识别。Li B X等[31]采集81个不同产地党参的近红外光谱, 主成分分析、随机森林法和K最近邻法对党参的产地进行鉴别。刘文杰等[32]采用傅里叶红外光谱法测定了4个不同产地的环草石斛光谱图, 通过比较谱峰强度的差异, 可对其进行鉴别。
药材的道地性主要通过外观、所含次生代谢产物、生境等特征来体现, 传统的鉴别和认定主要以产地和主观经验划分, 红外光谱以整体性、全息性等特点在道地性诠释及鉴别提出新的方法。
1.2.2 同种中药不同部位的鉴别
在中药的临床应用中, 药材不同部位的功效存在一定的差异, 为了确定药用的合理性, 需要借助一定的方法对药材进行科学区分。史国玉等[33]采用红外光谱三级鉴别法对丹参根、茎、叶和花4个不同部位的不同提取方法进行分析研究, 一维图谱表明花与根的相似度较高;二阶导数可提高分辨率谱, 近一步证明丹参不同部位具有差异。张声俊等[34]采用傅里叶变换光谱及其二阶导数谱对动物药全蝎由表及里8个部位的药材粉末进行分析, 发现全蝎不同部位的红外光谱较为相似, 而原始光谱通过二阶求导后峰位置和峰的强度有明显差异, 即样品不同部位所含化学成分具有差异。李建蕊等[35]亦用红外光谱法对三七的主根、剪口、筋条、绒根及形成层以外不同部位进行研究, 找出各部位的光谱特征, 化学之间的差异及相关性。随着中药传统非药用部位的兴起, 被弃用的部分逐渐被重视, 部分中药非药用部位中主要有效成分的含量高于传统药用部位的含量, 红外光谱对中药不同部位的分析与研究为中药资源的可持续利用提供一定的依据。
1.2.3 药材不同采收期的鉴别
中药材不同采收期的选择直接影响到中药材的质量, 根据传统经验皮类药材在其形成层活动旺盛时采收, 叶类药材在其叶茂盛的夏季采收, 根茎类宜秋冬季节采收。刘素利等[36]用红外光谱及主成分分析方法对16批次采收于春季和秋季的黄芩药材进行鉴别。对比红外谱图中特征峰的峰形的相对强度发现, 春季黄芩中黄酮类、酯类的含量要高于秋季黄芩;二阶导数谱表明春季黄芩中糖类成分要高, 而秋季黄芩所含的纤维素成分含量高;主成分分析方法可以快速判别黄芩样本的采收季节, 为黄芩适时采收提供了一定的依据。
Shi J Y等[37]用近红外光谱结合化学计量学方法对120个不同颜色 (绿色、黄绿色、黄色) 的银杏叶样品进行分析, 结果表明随着银杏叶的颜色由绿转黄, 其所含的总黄酮量逐渐增加;所测的3种不同颜色银杏叶总黄酮的平均含量分别为7.55 mg·g-1、15.72 mg·g-1、26.39 mg·g-1。随着生长时间的变化, 中药所含有效成分发生变化, 药效亦有差异, 由此对其的研究具有重要意义。与高效液相色谱法相比, 红外光谱法可简单、快速和准确地对不同采收期样品进行测定。
1.2.4 炮制品的鉴别
炮制对药物具有增效、减毒作用, 中药炮制过程中某些成分发生了变化, 进而会导致其生理活性的变化。因此, 在中药的炮制过程中, 实时监测其有效成分尤为重要。李冰宁等[38]用红外光谱技术对中药水蛭的炮制过程进行研究, 发现水蛭鲜品中酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ带的自动峰的强度比炮制品的更为显著, 说明水蛭炮制过程中蛋白质的空间构像被破坏、氢键断裂, 导致变性失活, 且水蛭中脂肪酸和甾醇类成分也发生变化, 阐明了水蛭在炮制过程中所含化学成分的变化。纪鹏等[39]利用傅里叶红外光谱法结合化学计量学方法对生当归和不同炮制品 (酒当归、油当归、土当归、当归碳) 中多糖进行研究, 并建立判别模型, 通过外部验证, 判别正确率达93.9%。黄冬兰等[40]对生三七和熟三七进行研究, 通过对光谱变化规律进行分析, 阐明了三七炮制前后化学成分的变化。不同的中药炮制品在临床使用范围有所不同, 开展中药炮制品的红外光谱研究, 实现炮制前后质量分析, 对其合理和安全的使用具有重要意义。
1.3 中药材活性成分的定量分析
红外光谱法与常用的定量分析方法相比具有快速、简便、无损等特点, 它可以全面反应中药分子结构, 具有较强的敏感性, 因而越来越多的应用到中药材及中药制剂的定量检测中。
徐宁等[41]利用近红外光谱对发酵冬虫夏草菌粉水分、腺苷进行定量测定, 研究发现通过对特定波段的选择并结合偏最小二乘法分别对水分、腺苷建立回归模型, 可对发酵冬虫夏草菌粉中水分和腺苷含量进行快速测定。孔德鑫等[42]用傅里叶红外光谱对曼地亚和南方红豆杉不同部位紫杉醇含量进行分析与评价, 结果表明, 运用傅里叶变换光谱结合外标法、二阶导数和线性拟合方法, 可以快速分析评价两种红豆杉及其不同部位紫杉醇含量的差异。张娟娟等[43]用近红外光谱法建立了麦冬中总皂苷及总黄酮的定量测定方法。唐进法等[44]运用近红外光谱法, 以高效液相色谱法为对照, 建立了快速、无损的测定柴胡药材中柴胡皂苷A的含量测定方法。Shao Q S等[45]用傅里叶近红外法结合偏最小二乘法对白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ进行定量测定。偏最小二乘法把光谱数据分解和回归进行融合, 有效的降维, 得到的特征因子与被测成分相关, 光谱最大程度的反应被测样品的信息, 将噪声降到最小, 该方法广泛用于定量模型的建立。
综上所述, 红外光谱法结合光谱预处理, 可以提高图谱的分辨率, 减少光谱噪声、光散射及样品不均匀等对模型的影响, 提高定性和定量模型的预测精度和稳健性;结合聚类分析、主成分分析、偏最小二乘判别分析化学计量学方法, 可以挖掘样品原始光谱中潜在的变量, 在客观的评价中药材的来源、真伪优劣的鉴别和评价起到重要作用。
2 红外光谱法在中药制剂分析中的应用
中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性, 是建立中药制剂现代质量标准体系的核心之一, 是解决药品质量控制及监管的关键途径。对中药制剂生产过程中进行在线检测, 可以从动态控制中药的生产, 提高中药生产过程的稳定性和可控性。
2.1 中药制剂及主要有效成分的检测
李斌等[3]采用近红外光谱法对16个不同厂家六味地黄丸进行研究, 通过对红外光谱模型的优化, 建模样品集样品的相关系数、校正标准差和平均相对误差分别为0.904 6%、0.058%、6.12%, 表明指纹图谱实测值和预测值之间存在良好的线性关系, 红外光谱直观的反映出不同生产厂家之间产品质量的差异。黄冬兰等[46]用一维红外光谱、二阶导数谱和二维相关红外光谱的红外光谱"三级鉴定"技术测定了桂林三金西瓜霜系列产品的红外光谱图, 根据光谱特征峰能够准确、全面的反映出不同产品中主要化学成分及所添加的辅料的差异。白雁等[47]用近红外光谱法结合高效液相色谱法对杞菊地黄丸中主要药效成分丹皮酚的含量进行测定。结果表明, 两种方法对该中成药中丹皮酚的含量测定无显著性差异。李蕾蕾等[48]用近红外光谱法结合偏最小二乘判别分析法快速和准确的建立了枇杷叶中齐墩果酸的定量分析模型。目前, 中药活性成分测定多为有损检测, 大量样品的测定耗费样品及耗时。红外光谱测定过程无需对样品进行复杂预处理, 结合化学计量学方法, 建立数学模型, 适用于中药中活性成分的快速及无损检测。
2.2 中药生产过程的在线检测
中药的提取、分离、浓缩等生产过程是中药生产过程中关键环节, 而在传统的提取、浓缩等过程中主要以提取时间或经验作为其判断终点的指标。然而中药物质组成复杂, 不同批次的药材之间存在差异, 从而造成提取终点与规定时间不相吻合, 出现提取时间过长或过短的情况, 而这些因素都会直接影响中药中有效成分的含量。近年来, 红外光谱作为一种新的在线实时监测方法应用于中药生产过程中。近红外透反射方法可以利用于中药渗漉过程中的快速分析, 该方法比常规检测方法简便、快速, 适用于中药制剂生产过程中在线检测和实时控制。
姜博海等[49]应用红外光谱结合偏最小二乘回归法、以高效液相色谱法为对照, 建立了伤疖膏制备过程提取液中黄芩苷定量模型, 结果表明两种方法所得的测量值基本吻合。刘桦等[50]利用近红外光谱法并结合高效液相色谱法和多元统计分析方法, 建立了积雪草药材柱层析过程中羟基积雪草苷和积雪草苷的定量检测模型。陈晨等[51]用近红外透反射光谱技术结合高效液相色谱法和偏最小二乘法对复方苦参注射液渗漉液中氧化槐果碱、氧化苦参碱、总糖、固体总量进行快速测定。类似研究尚有, 张金巍等[52]利用近红外光谱技术建立了芍药苷提取浓缩过程中定量模型。涂瑶生等[53]运用近红外光谱法结合高效液相色谱法快速测定川乌提取与浓缩过程中单酯型生物碱类成分, 进而准确的判断提取、浓缩终点。近红外光谱信号较弱, 信噪比较高, 结合化学计量学方法能够有效提取目标成分的信息, 广泛应用于中药定量分析;可实现完整样品的检测, 可透过包装材料进行测定, 较适合中药生产过程的分析, 为实现中药全程实时质量监控提供了科学依据。
诸多研究表明, 近红外光谱作为一种快速、无损和灵敏的分析方法, 能同时准确和精密测定样品中单一、多个组分的含量且无需大量的样品的制备;近红外在常规光纤中具有良好的传输特性, 使其在线性分析领域起到重要作用, 克服了传统离线分析技术样品预处理复杂及分析结果繁琐的缺点。已用于生产中质量实时和在线监控, 为中药现代化生产提供借鉴。
3 展望
综上所述, 中药红外光谱法较其他理化方法更加简便、专属性强, 可以提供被测物指纹信息。红外光谱为中药化学成分和结构研究的重要方法, 该种方法可以系统、全面的反映内部特征。目前, 红外光谱法广泛用于中药材真伪优劣鉴别、中药活性成分定量分析、中药制剂在线检测。然而, 红外光谱也存在许多缺点, 如不同方法提取光谱信息存在差异、样品取样数量大、数据处理较为复杂、不同仪器之间重现性相对差、模型通用性较弱等。随着光谱测定技术、计算机科学的发展, 红外光谱将很好地与计算机科学及化学计量学结合, 更好的应用于中药领域的研究。
